Métodos en "Microscopía rudimentaria".
Para poder observar al microscopio cualquier material, éste tiene que ser muy fino, ya que si el grosor excede a algunas décimas de milímetro la muestra será totalmente opaca cuando la observemos con luz transmitida (por transparencia) que es como se realizan la mayoría de las observaciones.
Esto no representa un problema cuando se trata de organismos unicelulares o de tejidos muy finos, como puede ser el epitelio de cebolla, pero si queremos observar la estructura histológica de órganos de animales o plantas, como puede ser una hoja, o un trozo de hígado o riñón, deberemos obtener secciones finas de dichos órganos.
Para estas observaciones los fragmentos de órganos deben tener la consistencia y disposición adecuadas que permita su manip
ulación y corte.
Todos sabemos lo dificil que puede ser cortar un grano de pìmienta por la mitad, pero si la pimienta forma parte de un salchichón podremos cortarla en varias rebanadas sin apenas dificultad.
Con las preparaciones de fragmentos de órganos ocurre algo parecido, es decir, deberemos incluirlas en un material adecuado que permita su manipulación y corte. Solo existe un pequeño problema respecto al ejemplo citado, y es que no solo deberemos incluir nuestra muestra en el medio elegido, sino que tendremos que conseguir que dicho medio impregne en su totalidad a la muestra. Si seguimos con el ejemplo no solo tendriamos que meter la pimienta en el salchichón, sino que deberíamos ser capaces de meter también el salchichón en la pimienta.
Esto, que a priori nos resultaría imposible, es lo que describiremos a continuación.
El proceso completo consta de cinco fases:
1. Fijación
2. Deshidratación
3. Inclusión
4. Preparación de bloques
5. Realización de las preparaciones
Fijación:
La fijación es un proceso que pretende mantener los materiales biológicos con el aspecto que tienen en el ser vivo. Si nosotros rompemos un huevo, la clara y la yema se extenderán y no se parecerá en nada al aspecto que tenía antes de romperlo, pero si pelamos un huevo duro, el aspecto será mucho más parecido al original. En este caso hemos realizado una fijación física, por calor. Algunas sustancias químicas consiguen efectos parecidos alterando las estructuras celulares mucho menos que las fijaciones físicas. Realmente la única fijación física que se emplea en la actualidad es la congelación, y solo cuando la necesidad de examinar las muestras rápidamente es importante, como puede ser durante el transcurso de una operación quirurgica.
Entre los fijadores químicos, uno de los más utilizados en microscopía óptica es el formol, que puede estar acompañado por otros como el alcohol o el ácido acético. Suele utilizarse disuelto en alguna solución amortiguadora de pH (tampón), en nuestro caso utilizaremos formol al 4% sin tamponar, es decir rebajaremos al 10% el formol comercial que viene al 40%.
El tamaño de las muestras es importante, ya que a mayor tamaño, mayor dificultad de penetración del fijador y del resto de sustancias que utilizaremos en el proceso. Aunque en función de la necesidad pueden utilizarse tamaños mayores, nosotros utilizaremos muestras entre 2 y 4 mm.
Deshidratación:
La materia viva contiene una cantidad elevada de agua. Mediante todo el proceso pretendemos sustituir ese agua por el medio de inclusión, encontrándonos con que los medios utilizados no son miscibles con el agua, y por tanto no sería posible la sustitución. Por ejemplo, si queremos conservar alimentos sumergidos en aceite, el aceite impedirá que el alimento esté en contacto con el exterior, pero no penetrará en el alimento, y mucho menos en las células que lo constituyen.
Pero el problema no es insoluble, simplemente se trata de buscar alguna sustancia que sea miscible con el agua y con el medio de inclusión. En la mayoría de los casos es necesario recurrir a dos sustancias.
En este caso utilizaremos alcohol. Si sumerjo las muestras en alcohol, al cabo de cierto tiempo gran parte del agua del interior de la muestra habrá sido sustituida por alcohol, y el alcohol se habrá rebajado un poco con el agua, por lo que tendremos que dar varios pasos hasta conseguir que el agua prácticamente haya desaparecido y en su lugar tendremos alcohol.
El problema ahora es que la mayoría de los medios de inclusión tampoco son solubles en alcohol.
Inclusión:
Ahora llega el momento de meter la pimienta en el salchichón y el salchichón en la pimienta.
Igual que en el paso anterior, deberemos sustituir, en este caso el alcohol: que se encuentra entre, y en el interior de las células; por otra sustancia que sea miscible con el medio de inclusión. Dependiendo del medio de inclusión se utilizan diferentes disolventes orgánicos, en nuestro caso utilizaremos acetona.
Después de varios pasos tendremos nuestra muestra, en la que toda el agua original habrá sido sustituida por acetona, siendo ahora el momento de introducir el medio de inclusión.
Tradicionalmente para microscopia óptica se utiliza la parafina y para microscopía electrónica las resinas epoxi, ya que las resinas son más duras y permiten hacer cortes mucho más finos. No debemos olvidar que para microscopía óptica deberíamos cortar nuestro grano de pimienta en 300-400 rebanadas, y eso no es nada comparado con las 30000-40000 que deberiamos cortar para microscopía electrónica.
Como en nuestro caso no dispondremos de aparatos de corte especializados (microtomos), sino que pretendemos reducir al tamaño adecuado mediante lijado de la muestra, necesitaremos emplear resina aunque sea para observar las preparaciones con un microscopio escolar.
Las resinas epoxi, que se encuentran fácilmente en el comercio, contienen dos envases (tubos o jeringas) de aproximadamente el mismo volumen, que endurecen en un tiempo variable, pero que el mejor de los casos sería insuficiente para permitir la impregnación completa de la muestra por esa razón vamos a recurrir a la resina de poliéster.
El poliéster tiene varias ventajas (es barato, solo hay que añadir unas gotas de catalizador y puede polimerizar por calor, casi sin catalizador), y algunos inconvenientes, el más importante que el medio se contrae ligeramente al polimerizar. Este inconveniente es el que ha hecho que se desestime su uso para microscopía electrónica, pero con los aumentos a los que nosotros trabajaremos carece de importancia.
Como la resina de poliéster es bastante más viscosa que la acetona es conveniente realizar el proceso de embebido con mezclas de resina/acetona cada vez más concentradas. Finalmente dejaremos un largo periodo, normalmente toda la noche, en resina pura, para que ésta ocupe la totalidad de la muestra.
Preparación de bloques:
Una vez que las muestras están totalmente embebidas en resina tenemos que crear los bloques.
En primer lugar prepararemos la resina añadiéndole unas gotas de catalizador. Es preferible quedarse corto, ya que siempre podremos acabar de polimerizar con calor. Si echamos demasiado esta resina no tendrá tiempo de penetrar en la muestra y no solidificará en el interior del tejido.
Una vez preparada la resina con el catalizador la verteremos a los moldes, insertando a continuación un papel con la numeración adecuada que nos permita después identificar la muestra. Debe escribirse a lápiz, ya que la tinta podría correrse con el poliéster, siendo aconsejable escribir por los dos lados del papel. Una vez añadida la etiqueta, añadiremos las muestras, asegurándonos de que se hundan, y esperaremos a que solidifique el bloque. Si transcurridas 24 horas el bloque sigue sin polimerizar, o está un poco pegajoso, lo meteremos en el horno a 50-60ºC.
En mi caso introduzco los moldes en recipientes herméticos de vidrio, para evitar olores indeseados, que puedan afectar a los alimentos que cocinemos después,
Realización de las preparaciones:
Cuando hayamos desmoldado los bloques los cortaremos con una segueta o sierra de marquetería para separar las muestras.
En mi caso las voy numerando con el número de bloque y una letra para poder seguir las muestras de forma individual.
El paso siguiente es tallar el fragmento de forma que la cara en la que aparece la muestra quede totalmente plana. Esto se consigue con lijas de agua de grano grueso (80-160).
Ahora puliremos esa cara con lijas de granos cada vez más finos. Podemos llegar hasta el 7000, pero si no tenemos lijas tan finas con el 3000 o incluso el 2000 será suficiente.
Cuando la muestra esté pulida Ia pegaremos, por esa cara, a un porta con resina epoxi.
Ya solo nos queda lijar con lijas gruesas hasta que tenga 1 o 2 mm, y después con lijas medias y finas hasta conseguir el grosor deseado.
Las imágenes nos muestran el aspecto al principio y al final del proceso, así como una tabla de equivalencias entre número de lija y tamaño de grano.
Descarga del documento PDF que recoge los materiales y métodos en detalle. Acceso a las micrografías obtenidas.